Foto: Jan Kopřiva/ pexels.com

“PCR testid ei ole usaldusväärsed,” sedastab teadlasi, arste, juriste ja teisi eksperte koondava Koroonateave.ee lehel värske artikkel, mille on koostanud Eesti biomeedik. Tegu on ametliku teabe ja teadusega, mis on kätte saadav kõigile, kes kasutavad internetti. Viited leiad artikli lõpust.

RT-PCR TESTI KASUTAMISE AMETLIK SELGITUS

Ägeda raskekujulise respiratoorse sündroomiga koroonaviirus 2 ehk SARS-CoV-2 (ehk lihtsustatult koroonaviirus) on RNA-viirus, mis põhjustab COVID-19 haigust. Üle maailma on selle nakkushaiguse testimise selgrooks RT-PCR ehk lühidalt PCR testid ning saadud igapäevase koroonapositiivsete statistika alusel modelleeritakse nakkuse levikut ning määratakse riikide sulgemisi.

Ametlikel andmetel selgitatakse PCR testi kasutamist alljärgnevalt:

Viiruse RNA määramine on nii Eestis kui kogu maailmas kasutusel COVID-19 esmaseks diagnoosimiseks ja nakkusjuhtumite avastamiseks. Testi kasuks räägib võimalus avastada viiruse olemasolu juba varajases staadiumis, mis aitab koheselt karantiini rakendada. Teine eelis on usaldusväärne tulemus: test on hästi tundlik (määrab ka juba väikest viiruse hulka) ning spetsiifiline.

Viiruse RNA on võimalik määrata nn klassikalisel real-time PCR (Polymerase chain reaction) meetodil, mille puhul on vaja spetsiifilist aparatuuri, eriväljaõppe saanud laborispetsialiste ning selleks kohandatud laboriprotsessi. Analoogne meetod on kasutusel nii Terviseameti, SYNLABi kui mitme haigla laborites ja sel moel on võimalik teostada suhteliselt suures mahus uuringuid.

Ent ajal, mil me seisame silmitsi rangete sulgemiste ja kehtestatud piirangutega, mis on otsene rünnak inimeste põhiõiguste ja isikuvabaduste vastu ning mis põhjustab pöördumatut kahju kogu majandusele globaalses mastaabis; on eluliselt oluline aru saada PCR analüüsi tegelikust olemusest ja sellega kaasnevast andmemanipulatsioonist nn koroonadiagnostikas.

PCR TESTI OLEMUS

Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR (i.k.) on meetod mingi kindla, huvi pakkuva DNA lõigu paljundamiseks. Tõese tulemuse saamiseks on eeldus, et uuritava DNA nukleotiidne järjestus ON TEADA. Järjestuste põhjal sünteesitakse komplementaarsusprintsiibil põhinevad lühikesed, üksik-ahelalised DNA fragmendid ehk praimerid. Paljundamise käigus lagundadakse uuritav DNA lõik kaheks üksikahelaks ning nendega seondunud praimerite põhjal sünteesitakse mõlemad ahelad tagasi kaksikahelaks. Tulemusel saadakse ühest DNA lõigust kaks samasugust DNA ahelat. Tsükleid korratakse ja uuritava DNA lõikude arv kasvab eksponentsiaalselt. Seetõttu on PCR abil võimalik saada lühikese aja jooksul vähesest DNA proovi kogusest miljoneid ja miljardeid koopiaid.

Tänu oma kiiruse, kasutamislihtsuse ja tundlikkusele on meetod väga laialt levinud erinevates valdkondades, sealhulgas nakkushaiguste tuvastamisel. RNA-viiruste, nagu koroonaviirus, puhul lisatakse meetodile täiendav sünteesietapp — pöördtranskriptsioon —, kus vastavalt komplementaarsusprintsiibile saadakse viiruse RNA esmalt DNA, mida seejärel paljundatakse PCR käigus. Tulemust monitooritakse sageli reaalajas ja selline PCR analüüsi variatsioon kannab nimetust rRT-PCR (real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction).

Ükski meetod pole siiski veatu ning vajab valideerimist ja kalibreerimist. PCR praimerid on küll lõiguspetsiifilised, ja sisuliselt võib väita, et lõigu X jaoks disainitud praimeritega ei saa paljundada lõiku Y. Siis iga konkreetse PCR protokolli väljatöötamisel on lisaks mitmeid keemilis-füüsikalisi jm parameetreid, mis määravad analüüsi tulemuse. Samuti mängivad olulist rolli testi käigus tekkivad juhuslikud mutatsioonid, ristreostumise võimalikkus, mittespetsiifilised seondumised, inimfaktor jp.

PCR TESTI SOBIVUSEST KOROONAVIIRUSE TUVASTAMISEL

RT-PCR on tunnistatud kuldstandardiks koroonaviiruse testmisel, mis on juba fundamentaalselt väär. Sisuliselt tähendab “kuldstandard” kõige täpsemat saadaolevat meetodit, ent konkreetselt SARS-CoV-2 vastu disainitud RT-PCR on palju puudusi ja vasturääkivusi. Puudustega testi on aga võimatu käsitleda kuldstandadrina. Kõigil neil PCR analüüsi peennüanssidel peatumine oleks liialt mahukas ning siinkohal piirduks koroonatestimise kontekstis peamiste oluliste faktoritega.

Siinkohal tuleb mõista, et vaatamata ametlikule kõnepruugile “tuvastati koroonaviirus”, EI OLE ükski PCR suuteline viirust (veel vähem viirusest tulenevat haigust) kui sellist TUVASTAMA. PCR testi puhul LEITAKSE ÜLES ja PALJUNDATAKSE vaid viiruse geneetilist materjali, mitte aga viirust ennast.

Viiruse tuvastamine aga toimub mitme teineteist toetava meetodi abil. Pärast inimeselt saadud viirusproovi paljundamist (PCR) tuleks saadud DNA produkt ka kontrollida (nt blottimine, sekveneerimine jt) ning tõendada selle aktiivsus ehk nakkavus ja/või virulentsus (nt rakkude kultiveerimine, kliinilised sümptomid jt). Seejärel alles saaks mingilgi määral rääkida viiruse tuvastamisest, nakatumisest ja haigestumisest.

Nakkavus — viiruse võime levida peremeesorganismide seas (= teisi nakatada).

Virulentsus — viiruse võime peremeesorganismi nakatada või kahjustada (= ise haigestuda).

KASUTATAVATE TESTIDE KASUTAMISE EELDUS

Hetkel käibel olevate tuntud tootjate koroonaviiruse RT-PCR testide aluseks on Corman-Drosteni publikatsioon (mida 22 tuntud teadlast soovivad tagasi kutsuda – Telegrami märkus). Samuti lähtuvad sellest WHO, CDC, jt oma suunitlustes ja korraldustes. Üks olulisi mõttekohti on see, et kogu Corman-Dorsteni töö baseerub koroonaviiruse teoreetilisel DNA järjestusel. Ehk teisisõnu on eeldatud, et uus viirus sarnaneb varasemale SARS-CoV (2003) ning selle põhjal on genereeritud oletuslik SARS-CoV-2 DNA järjestus, mille alusel kogu protokoll loodud on.

Algselt, tegeliku viirusmaterjali puudumise tõttu, on see samm mõistetav ja mõneti isegi õigustatud. Kuid hetkeolukorras, kus päris viirus on kergelt kättesaadav ja hõlpsasti eraldatav, tuleks protokoll viia vastavusse tegeliku viraalse DNA järjestusele. Geneetiline sugulus ainuüksi ei täida diagnostilise testi (veel vähem kuldstandardi) eesmärki, kuna ristreaktiivsuse tõttu ilmnevad paratamatult valepositiivsed tulemused.

Siiani aga seda tehtud pole ning PCR testide positiivsed kontollid sisaldavad endiselt SARS-Cov-2 tehislikku DNA järjestust, mis põhineb pelgalt hüpoteesil. Seega korrektselt väljendatuna hetkel lihtsalt oletatakse, et testitakse SARS-CoV-2 vastu.

​

VIIRUS VÕI VIIRUSE OSAKE – MILLES ON VAHE?

Teiseks oluliseks aspektiks on koroonaviiruse testimisel sihtmärk. Oletades, et isegi juhul kui hüpoteetilise järjestusega on õnnestunud luua 100% identne SARS-CoV-2 järjestus, siis sihtmärkideks on koroonaviiruse testimisel võetud vaid viiruse teatud DNA-regioonid ning ligikaudu pool viirusest jääb tegelikult tuvastamata. Teisisõnu leitakse ja paljundatakse viirusfragmente, mitte aga viiruse DNA-järjestust tervikuna.

Laboratoorsete teadusuuringute seisukohalt, kus uuritakse viirust ennast ja selle funktsioone, on selline lähenemine iseenesest täiesti asjakohane. Kuid selliselt disainitud PCR testi kasutamine COVID-19 esmaseks diagnoosimiseks ja nakkusjuhtumite avastamiseks on ülimalt ennatlik ja pinnapealne.

Aktiivne ehk nakkusohtlik viirus töötab tervikuna, viiruse üksikud fragmendid on aga reeglina inaktiivsed ja kahjutud. Eksisteerib küll olukordi, kus inaktiveerunud viirusefragment on säilitanud oma funktsionaalsuse ja suudab organismis tekitada teatavat kahju, juhul kui soodsate asjaolude kokkulangevusel selline fragment rakku transporditakse. Sellised juhtumid on aga pigem erandlikult ja terve organism suudab taolise välise ärritajaga suurepäraselt ka iseseisvalt toime tulla.

Seega EI TÕESTA viirusfragmendi olemasolu organismis tegeliku viiruse olemasolu, vaid näitab lihtsalt seda, et on toimunud kokkupuude viraalse materjaliga. Seejuures võib leitud viirusefragment omakorda olla juba väiksema(te)ks ühiku(te)ks lõhutud ja funktsionaalselt pärsitud.

Inimene puutub igapäevaselt kokku üüratu koguse erineva viraalse materjaliga. Eeldusel, et koroonaviirus on kiirelt ja aerosoolselt leviv viirus, siis tõenäosus puutuda kokku ka SARS-CoV-2 lenduvate osakestega on üsna suur. Epidemioloogias on aeg kriitiline faktor ning nakkushaiguse leviku piiramiseks tuleb kiirelt reageerida. Kui PCR tulemusel on huvialusel isikul leitud koroonaviiruse fragmente, oleks mõistlik rakendada paaripäevane isolatsioon, samal ajal tuleks teostada järelkontroll leitud fragmentide osas ning tõendada, et leitud fragmendid ka nakkuslikud või virulentsed on.

​

VEAD PCR TESTIMISE RAKENDAMISEL SENISEL KUJUL

Vaatame veel kord ametlikku sõnastust:

Viiruse RNA määramine on nii Eestis kui kogu maailmas kasutusel COVID-19 esmaseks diagnoosimiseks ja nakkusjuhtumite avastamiseks. Testi kasuks räägib võimalus avastada viiruse olemasolu …, mis aitab koheselt karantiini rakendada.  

Samas ütleb CDC selgesõnaliselt oma juhistes, et

viiruse RNA tuvastamine ei pruugi viidata nakkusliku viiruse esinemisele või et 2019-nCoV on kliiniliste sümptomite tekitaja.

Kuna PCR test üksinda ei tee vahet kogu viiruse ja viirusefragmentide vahel, EI SAA seda testi kasutada AINUKESE meetodina nakkuslike viiruste diagnostikas ja viirusinfektsiooni olemasolu kohta järelduste tegemiseks. Paraku näitab aga käimasolev koroonatestimise praktika vastupidist ning inimesi isoleeritakse valedel alustel.

Ametlik käsitlus selgitab:

Teine eelis on usaldusväärne tulemus: test on hästi tundlik (määrab ka juba väikest viiruse hulka) ning spetsiifiline.

Kuid tänu PCR tundlikkusele on just usaldusväärsus muutunud üheks olulisemaks murekohaks koroonaviiruse testimisel. Vastupidiselt epidemioloogilisele tavale on tervishoiuasutused käsitlenud vaid üht PCR-positiivset tulemust nakkuse kinnitusena. Eeldus aga põhineb ARVAMUSEL, et nende testide positiivsed tulemused on väga usaldusväärsed. Väliste kvaliteedihinnangute ja reaalsete andmete põhjal saadud tõendid näitavad siiski piisavalt kõrget valepositiivsete määra ning on seetõttu paljude stsenaariumide puhul väga ebausaldusväärsed.

PCR paljundab viiruse geneetilist materjali tsüklitena. Nagu eelpool mainitud, on tegemist eksponentsiaalse kasvuga. Mida väiksem on paljundamise tsüklite arv, seda suurem on viiruskoormus ehk seda rohkem on viiruse geneetilist materjali uuritavas proovis. Mida suurem on aga viiruskoormus, seda tõenäolisem on ka viiruse nakkavus ja virulentsus. Ning vastupidi — mida suurem on tsüklite arv, seda väiksem on viiruskoormus ja seda vähem tõenäoline on ka viiruse nakkavus ja virulentsus.

Nakkushaiguste uurimisega seotud PCR analüüside praktikas on optimaalne paljundustsüklite arv u. 20-30 tsüklit.

30-35 tsüklit on nn hall tsoon, kus positiivne tulemus on juba vaieldav.

Alates 35 tsüklist on reeglina tegu mittenakkusliku ja -virulentse viirusmaterjaliga ehk nn surnud viirusega.

Ning tsüklite arvu juures 40+ peetakse meetodit juba ebausaldusväärseks tänu märgatavalt suurenenud valepositiivsete tulemuste osakaalule, mille tingivad ülevõimenduse käigus tekkivad  mutatsioonid, ristreostust, mittespetsiifilised seondumised jpt.

Paljud uuringud näitavad, et rohkem kui 32-tsüklilistel PCR analüüsidel ei ole enam kliinilist asjakohasust ja kasutatavad koroonaviiruse PCR testid on 100 kuni 1000 korda tundlikumad, kui need olema peaksid.

Teadlaskonna kriitika survel on olukorrale lõpuks tähelepanu juhtinud ka WHO ja CDC oma viimastes koroonaviiruse testimise suunitlustes. Ometigi on jätkuvalt enamikes riikides (k.a Eestis) käibelolevate koroonaviiruse PCR protokollides tsüklite arv vahemikus 38-45. Seega on PCR testide üks eelistest — tundlikkus — muutunud pigem puuduseks koroonaviiruse testimisel.

​

STATISTIKA ÜMBERVAATAMISE VAJADUS

Ülitundliku PCR testi tulemusel ei saa kindel olla, kes positiivse tulemuse saanutest üleüldse tegelikult positiivne ja nakkusohtlik on. Sealhulgas seab see ka kahtluse alla suremuse koroonaviirusesse.

Seetõttu on äärmiselt oluline, et valepositiivsete eraldamiseks tegelikest  positiivsetest tuleks paljundamistsüklite arv viia palju madalamale, kui see seni on. Samuti aitaks see eraldada tegelike positiivsete seast suure ja väikse viiruskoormusega isikud, et seeläbi eristada nakkusohtlikud mittenakkusohtlikest.

Vähese viraalse materjaliga kokkupuutunu on väikese viiruskoormusega. PCR test on võimeline üles leidma ka selle vähese ning ülevõimendatud paljundamise käigus väljastama positiivse tulemuse. Kui samaaegselt haigustunnused puuduvad, tunnistatakse TA juhendi põhjal selline isik koheselt asümptomaatiliseks. Tegelikult aga on tegemist terve ning enesele ja teistele ohutu inimesega, kuna töökorras immuunsussüsteem saab suurepäraselt hakkama väikese ja ka keskmise viiruskoormusega. Seega sildistatakse terve inimene haigeks.

Asümptomaatiliseks saab pidada isikut, kel puuduvad küll haiguse tunnused, kuid kelle viiruskoormus on suur. PCR paljundamistsüklite arvu vähendamine võimaldaks hinnata viiruskoormust, kuid endiselt säiliks ülioluline küsimus: kas viirus on nakkuslik ja/või virulentne?

PCR analüüs üksinda ei suuda sellele küsimusele vastata ja lõpliku hinnangu andmiseks (sealh inimese isoleerimiseks) tuleks PCR-positiivsetele kindlasti teostada järelkontroll ja tõendus kasutades täiendavaid meetodeid.

Valideeritud ja õigesti kalibreeritud PCR testidel on oma õiguspärane koht nakkushaiguste uurimisel. Samas PCR analüüs üksinda pole võimeline koroonaviirust tuvastama. Seetõttu on ülimalt oluline analüüsida PCR tulemusi kõrvuti teiste toetavate meetoditega. Alles siis saaks teha paikapidavaid järeldusi nakkuse leviku jms osas.

KOKKUVÕTTEKS

Valesti kalibreeritud testi 1-2 tulemuse alusel hinnangu andmine mõjutab mitmesuguseid statistilisi andmeid, sealh asümptomaatilist suhet, levimust, haiglaravi ja suremust. Valeandmete põhjal saadud epidemioloogiliste mudelite põhjal ei saa aga haigusega võidelda ning neile tuginevad piirangud on inimeste põhiõigusi ja isikuvabadust rikkuvad. Seega tuleks kiiremas korras lõpetada inimeste sildistamine ning astuda samme valepositiivsete teadlikkuse tõstmiseks ja nende ilmnemise vähendamiseks, eelkõige positiivsete tulemuste kontrollimisega täiendavate testidega.

Valitsused kehtestavad ja vabastavad piiranguid tuginedes ekspertarvamustele. Ometigi näitab hetkeolukord, et ekpertarvamused on eksinud elementaarsete nakkuse tuvastamise ja leviku määramise printsiipide osas. See aga püstitab omakorda küsimuse, kelle huve selline ekspert tegelikult kaitseb?

Toimetas Koroonateave.ee

​Allikas: Koroonateave.ee

VIITED

Nagpal, M. L. et al. (2020) Synthetic Biology – New Interdisciplinary Science. Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications. ISBN: 978-1-78984-090-2

Nagpal, M. L. et al. (2020) Synthetic Biology – New Interdisciplinary Science. PCR and Infectious Diseases. ISBN: 978-1-78984-090-2

Corman, V. M et al. (2020) Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR.

Borger, P. et al. (2020) External peer review of the RTPCR test to detect SARS-CoV-2 reveals 10 major scientific flaws at the molecular and methodological level: consequences for false positive results.

Watson, J. et al. (2020) Interpreting a covid-19 test result. https://www.bmj.com/content/bmj/369/bmj.m1808.full.pdf

Engelbrecht, T. & Demeter, K. (2020) COVID19 PCR Tests are Scientifically Meaningless.

La Scola, B. et al. (2020) Viral RNA load as determined by cell culture as a management tool for discharge of SARS-CoV-2 patients from infectious disease wards.

Surkova, E. et al. (2020) False-positive COVID-19 results: hidden problems and costs. https://www.thelancet.com/journals/lanres/article/PIIS2213-2600(20)30453-7/fulltext

Lee, M. (2020) COVID Test Scam: Cycle Threshold Values Being Deliberately Omitted.

Levinson, S. S. (2020) False Positive Results in Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR) for SARS-CoV-2?

Bullard, J. et al. (2020) Predicting infectious SARS-CoV-2 from diagnostic samples. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32442256/

WHO (2021) Nucleic acid testing (NAT) technologies that use polymerase chain reaction (PCR) for detection of SARS-CoV-2.

CDC (2020) 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel.

Jefferson, T. et al. (2020) Viral cultures for COVID-19 infectivity assessment. Systematic review. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

Service, R. F.  (2020) One number could help reveal how infectious a COVID-19 patient is. Should test results include it?

Cohen, A. N. et al. (2020) Diagnosing COVID-19 infection: the danger of over-reliance on positive test results. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.26.20080911v4